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液相色譜柱的選擇方法概述
發布時間:2019-12-10   點擊次數:1884次

液相色譜柱的選擇方法概述

選擇方法一:填料的種類

填料的基質一般選擇使用多孔硅膠或聚合物等,在細孔的表面有多種經過化學修飾的官能團。

利用目標成分疏水性的不同起到分離效果的反相分離模式,利用極性不同進行分離的正相分離模式,根據分子大小的不同而分離的尺寸排阻模式,根據離子性質的不同而達到分離的離子交換模式,又或者分離光學異構體等,根據目的的不同,需要

選擇對應的填料。

作為填充劑的代表十八烷基、辛基、丁基等即在硅膠的細孔表面化學鍵合的 C18(ODS)、C8 或 C4 等,碳鏈越長,疏水性(保留能力)越強。

 

選擇方法二:填料孔徑

多孔硅膠為基體的填料表面具有無數的細孔,需要根據目的成分的分子量選擇對應大小的填料孔徑。微孔徑 100Å(10nm)對 應 5000 左右 的 分 子 量。 分 子 量 大 于 5000 的, 可 以 選 擇300Å(30nm)或以上的大孔徑柱子。目的成分能夠進入孔的話,才能與官能團相互作用從而起到分離的效果。對于大分子蛋白質或聚合物等高分子,如果不是大孔徑的基體,與官能團的相互作用就會減少。另外,分析低分子時,選擇太大的微孔,由于會擴散故導致峰型可能會展寬。

 

選擇方法三:填料粒徑

一般 HPLC 多使用粒徑為 5μm 的球狀硅膠,近年來也逐步開始使用 2μm 以下的微粒子,粒徑越小色譜柱理論塔板數就越高,得到峰型也就越尖銳,分離越好。而且,粒徑越小,即使流速上升,理論塔板數降低很少,微粒子色譜柱越來越適合快速分析。但是,微粒子使用時,必須注意使用壓力。3μm 以下適合UHPLC快速分析,3 ~ 5μm 適合一般的 HPLC 柱分析,10μm 則作為制備 HPLC 柱使用。

 

選擇方法四:色譜柱尺寸 (長度)

一般使用較多的色譜柱的長度,通用型,制備 HPLC 柱長度為150 ~ 250mm,LC/MS 為 100-150mm,超快速 HPLC(UHPLC)為 50-100mm。色譜柱長度越長理論塔板數也越高。只是,需要注意,色譜柱長度加倍后,分析時間與使用壓力也會加倍。

對于 2μm 或者 3μm 的微粒子,分離度和理論塔板數都較好時,將色譜柱的長度變短,可以縮短分析時間,進行快速分析。

 

選擇方法五:色譜柱尺寸 (內徑)

一般通用的 HPLC 柱內徑為 4.6mm,LC/MS 內徑多為 2.1mm,毛細管 HPLC 色譜柱為不滿 1mm,制備 HPLC 色譜柱6.0mm 以上。通用 HPLC 系列,內徑不同得到的結果也不同。即使改變內徑,根據色譜柱的截面積比改變相應的流速,保留時間基本不會改變。特別是對于像 UV、RI 一樣對于濃度要求很高的檢測器而言,流速越小,其對應的靈敏度也越高。需要注意的是,通用型 HPLC 色譜柱內徑太小,裝置的死體積(管路內多余的配管或者流通池容量)影響變大,峰型會變寬。并且根據 HPLC 系統使用目的的不同(分析、制備、毛細管等)種類也不同,能夠設定的正確的流速與流速范圍,系統響應等也會不同,所以根據系統不同選擇對應的內徑是十分重要的。

 

選擇方法六:端基封尾

端基封尾是硅膠表面有一種被稱為硅醇基的弱酸性官能團(Si-OH)存在。作為反相分配填料等合成時,利用硅醇基對十八烷基(ODS:C18)進行化學鍵合。然而,部分沒有鍵合殘留的硅醇基會與堿性化合物吸附,引起峰拖尾。為了防止這種現象,使用甲基等短鏈基團對殘存硅醇基進行處理,這個過程就稱作端基封尾。選擇 ODS 色譜柱時,請選擇進行端基封尾的柱子。下述作為參考,反相色譜柱的一些相互作用。

 

相互作用的類型:

◆疏水性相互作用

疏水性高的物質之間會有相互牽引作用,與相似相溶道理一樣,填料結合基團的碳鏈(烷基鏈)越長疏水性越高。

◆離子性相互作用

在反相分析中,弱酸性的硅醇基能與堿性化合物結合,與酸性化合物會發生排斥,會對峰型及保留時間有影響。更適合使用端基封尾處理的柱子或者調節溶劑的 PH 值,抑制這種作用。

◆氫鍵

氫原子易與電負性高的原子發生結合,如與氧、氮、硫、鹵素以及芳香環的 π 電子等作用。

◆π 電子相互作用

像苯環這類具有 π 電子結構的化合物,相互之間會有電子吸引作用。像苯基柱這類具 π 電子作用的柱子,對于目標物的 π 電子具有選擇性,通過此相互作用起到分離效果。

◆金屬配位吸附

填充劑硅膠基質內會含有部分殘留的金屬,故易會引起配位化合物的吸附現象。而且,解離的硅醇基與金屬離子一旦發生配位,會發生峰拖尾或者目的成分不能被洗脫的狀況。

 

選擇方法七:色譜柱接頭形式

HPLC 色譜柱的接頭根據廠家的不同也會有不同。一般分析色譜柱是 1/16 英寸外徑的管子使用螺絲進行連接,若連接不同的接口,較易產生死體積與漏液現象。

特別對于不銹鋼的配管等,需用套圈固定管子,就必須選擇對應的接口形式。

接口形式和螺距有英寸螺距和毫米螺距兩種。一般 Waters 接口型使用比較普遍。無論是 HPLC 或 UHPLC,通過選擇適當的色譜柱接口形式,InertSustain 以及 Inertsil 的性能能夠充分的發揮(標準接口為 Waters 接口型)。

 

選擇方法八:經常使用的色譜柱規格

◆HPLC 分析

5μm, 150×4.6mm I.D.

5μm, 250×4.6mm I.D.

◆UHPLC, LC/MS 分析

2μm, 50×2.1mm I.D.

2μm, 100×2.1mm I.D.

3μm, 75×2.1mm I.D.

◆LC/MS 分析

3μm, 100×2.1mm I.D.

3μm, 150×2.1mm I.D.

5μm, 150×2.1mm I.D

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